유전자 가위의 백질
2세대 유전자 가위는 ZFN의 인식 영역을 징크 핑거 단백질 대신 TALE 단백질로 대체한 유전자 가위로 TALEN (Transcriptor Activator – Like Effector Nuclease 으로 불린다. TALE 단백질은 단백질 1개 가 1개의 염기를 인식하므로 징크 핑거 단백질에 비해 제작이 좀 더 용이하고 정교한 인식이 가능하다는 장점을 지닌다. 다만, 이의 반대 급부로 TALEN은 인식 영역의 단백질의 크기가 매우 커지기 때문에 세포 안으로 주입하기 어렵다는 단점도 동시에 발생하게 된다. 1세대, 2세대 유전자 가위가 인식 영역에 단백질을 활용하는 것과는 달리 3세대 유전자 가위는 RNA를 활용하는 것이 주된 특징이다. 3세대 유전자 가위의 인식 영역은 세균의 CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)에서 유래된 것으로, 세균은 외부에서 유전자가 침입해 오면 이를 분해하고 파괴한 후 파괴한 외부 유전자의 일부를 저장해 두었다가 다시 침입해올 경우 바이러스를 인식하는 RNA(가이드 RNA)를 만들고 여기에 절단 효소인 Cas9(CRISPR-associated gene number 9)을 결합하여 바이러스에 대항하는 면역 체계를 갖고 있다. 3세대 유전자 가위는 이 같은 현상을 이용하여 가이드 RNA를 인공적으로 제작하여 원하는 DNA를 절단하는데 활용하는 기술로 CRISPR/Cas9이라고 불리며 최근 Cas9을 대체할 수 있는 다양한 절단 효소가 개발되고 있어 3세대 유전자 가위는 CRISPR RNA-Guided Nuclease 라고 도 불리고 있다. CRISPR 기술은 1세대나 2세대 기술과 달리 단백질 합성을 필요로 하지 않아 제작이 매우 쉽다는 장점을 가진다. 유전자 편집 기술을 이용하여 개발된 작물은 범용적으로 산물의 특징에 따라 SDN1, SDN2, SDN3으로 구분되고 있다. 2012년 유럽 식품 안전청(EFSA)은 유전자 편집 기술을 적용한 작물의 안전성 평가를 용이하게 하기 위하여 ZFN 기술을 ZFN-1, ZFN-2, ZFN-3 기술로 분류하고 각각을 다음과 같이 정의하였다. ZFN-1은 비상동 말단 연결(Non-Homologous End Joining, NHEJ)21) 기작에 의하여 단일 염기의 변화, 짧은 염기의 삽입 또는 결실이 일어난 것으로 이중나선의 절단 후 교정 과정에서 주형 가닥(repair template)을 사용하지 않아야 한다고 정의하였다. 또한 삽입의 경우 삽입된 염기는 반드시 자신의 게놈으로부터 유래된 것으로 외부에서 삽입되지 않아야 한다. ZFN-2는 상동성 재 조합 기작(homologous recombination, HR)22)에 의하여 특정 단일 또는 작은 수의 염기가 변화, 삽입, 결실 등이 일어나는 점 돌연변이의 경우로 한정하였다. ZFN-2는 점 돌연변이를 도입하기 위하여 target DNA와 상동성 이면서 도입하기를 원하는 점 돌연변이를 포함하는 DNA 주형 가닥을 사용한다. ZFN-3는 HR기작을 이용하여 외래 DNA단편 또는 유전자 카셋트를 도입한 것으로 정의하였다. 이때 도입된 DNA단편의 길이는 수 천 염기 쌍까지 포함한다고 하였다. 그리고 실제로는 HR뿐만 아니라 NHEJ 기작에 의하여도 특정 외래 DNA 단편의 도입도 일어날 수 있으며 이 경우를 특별히 ZFN3-NHEJ로 구분하였다. EFSA는 이러한 등급 구분 체계는 TALENS와 CRISPR 그리고 앞으로 새로이 개발되는 모든 유전자편집기술에도 동일하게 적용하여 이들 SDN 기술을 SDN-1, SDN-2, SDN-3로 구분하고 특히 SDN-3에 해당하는 것들은 외래 DNA단편을 사전에 알고 있는 위치(predefined region)에 삽입한다는 것 외에는 기존의 유전자변형생물체와 동일한 것으로 간주하고 안전성 평가 과정을 필 하여야 한다고 주장하였다.23) 여기서 SDN이라는 용어는 부위 특이적 핵산 분해 효소(Site Directed Nucleases)를 가리키며 특정 위치에서 유전자 돌연변이나 유전 물질의 삽입 또는 삭제를 가능케 하는 여러 형태의 단백질 화합물을 의미한다.