추출 방법에 따른 홍삼의 효과

추출 방법에 따른 홍삼의 효과

최근 우리 나라는 인구의 초 고령화와 더불어 서구화 된 식생활로 인해 고지혈증, 고혈압, 당뇨병 등의 생활 습관병 유병률이 증가하고 있다. 이를 예방하고 건강을 증진하기 위한 다양한 기능성 식품의 요구 및 소비 또한 증가 추세이며, 인삼은 그 중 가장 대표적인 기능성 식품이다. 오래전부터 동양 권에서 인삼의 다양한 효능이 알려져 있으며, 전통적으로 민간요법, 차 혹은 요리에 많이 활용되어 왔다. 인삼은 가공하지 않은 자연상태 그대로 인 수삼과 가공 방법에 따라 백삼, 홍삼, 흑삼으로 분류된다. 수삼을 햇볕이나 열풍 등의 방법으로 건조 시키면 백삼이며, 껍질이 있는 상태에서 찐 후에 말리면 홍삼이다. 수삼을 아홉 번 찌고 말리는 과정을 반복하는 전통적 한약의 가공 법인 ‘구증 구포’ 로 제조 된 인삼은 점차 검은색을 띠게 되어 흑삼이라 불린다(이지현 외, 2006). 이와 같은 다양한 가공 법으로 인삼의 보존력과 주요 성분 함량을 변화시켜 효능을 향상시킬 수 있으며, 특히 홍삼과 흑삼의 경우 열처리 과정에서 각종 효소들이 불 활성화되어 저장성이 좋아질 뿐 아니라 전분 입자가 호화 되어 백삼보다 소화율이 증가된다. 홍삼은 아시아 국가에서 여러 질병을 치료하기 위한 전통적 약재로 사용되어 왔다(Lee et al., 2015). 홍삼에는 면역, 피로, 알레르기, 암에 약리학 적 효과가 있으며(Choi et al., 2011; Kee et al., 2017), 홍삼에 있는 주요 성분인 진세 노사이드(ginsenoside)들 중, Rg3, Rh1, Rh2, Rh4, Rf2 등이 한국 홍삼에 존재하는 것으로 알려져 있다. 이 중 Rh1은 비알코올성 지방간이나 만성 염증 질환을 완화한다고 보고 하였다(Chen et al., 2017; Li et al., 2014). 또한 홍삼은 면역 체계를 조절하여 질병에 대한 저항력을 향상 시킨다고 알려졌으며, 특히 고려 홍삼의 농도에 따른 비장에 있는 면역 세포의 기능 향상을 보고하였다. 그러나 현재까지 추출 방법에 따른 홍삼 추출물의 기능성을 비교한 연구는 여전히 부족하다. 이에 본 연구에서는 교반법과 초음파를 이용한 홍삼 에탄올 추출물의 항산화 기능을 비교하고, 각각의 추출물을 처리한 RAW264.7 면역세포에 염증을 일으킨 후 COX-2의 발현양을 조사하여 각 추출법에 따른 추출물의 항염증 효과를 조사하였다. 본 연구에서 홍삼은 금산에서 재배된 4년생 고려 홍삼 가루(Yangjihongsam, Geumsan, Korea)를 구입하여 사용하였다. 홍삼 시료의 교반 추출을 위해 홍삼 시료 5 g에 80 % 에탄올(Daejung Chemicals & Metals, Siheung-si, Korea) 30 mL을 혼합한 후 마그네틱 플레이트 에서 3분간 300 rpm의 속도로 교반 후 Whatman No.1 여과지(Whatman, Maid Stone, UK)로 여과하여 여과액을 수집하였다. 이 여과액에 새로운 10 mL의 에탄올을 혼합하고 동일하게 교반 후 여과지를 통해 여과액을 수집하였고 이 과정을 추가 반복하여 50 mL의 추출액을 수집하였다. 100 mg/ml로 농도를 맞춘 추출액은 0.2 μm membrane(Biofact, Daejeon, Korea)에 여과하여 -20 °C에서 보관하였다. 홍삼 시료의 초음파(ultrasound) 추출을 위해 시료 5 g에 80 % 에탄올 30 mL를 혼합한 후 40 KHz 초음파기(DAIHAN® Analog Ultrasonic Cleaner “WUC-A”, DAIHAN Scientific, Daegu, Korea)에서 15분 동안 추출한 후 Whatman No.1 여과지로 여과 하는 과정을 3번 반복하여 50 mL 초음파 추출액을 준비하였다. 추출액의 농도는 100 mg/mL로 맞추어 0.2 μm membrane에 여과 후 -20 °C에 보관하였다. 교반과 초음파 추출법으로 준비된 홍삼 추출액을 1/2 로 각각 희석 후 원액과 희석액의 총 페놀 함량을 Folin-Ciocalteu 법을 변형하여 측정하였다. 2 % Na2CO3(Daejung Chemicals & Metals, Gyeonggi-do, Korea) 용액 20 mL 를 시료 추출액 0.2 mL 와 혼합하고 2 분 뒤 50 % Folin-Ciocalteu’s (JUNSEI, Kyoto, Japan) 시약 0.2 mL 를 넣고 섞은 후 상온에서 30 분간 방치한 후 UV-1800 UV-VIS 분광 광도계(uv-1800 uv/visible scanning spectrophotometer SHIMADZU, Kyoto, JAPAN)를 사용하여 750 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Ferulic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준 물질로 사용하여 μg Ferulic Acid Equivalent(FAE)/mL 로 표시하였다. 교반 추출 법과 초음파 추출 법으로 준비된 홍삼 추출 액을 1/2로 각각 희석 후 원액과 희석 액의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 시료 추출물 0.2 mL에 2 mL의 diethylene glycol(Daejung Chemicals & Metals)과 0.2 mL의 1 N NaOH(Daejung Chemicals & Metals)를 첨가하여 37 °C의 water bath (B-491, Buchi labortechnik AG, Flawil, Switzerland) 에서 1시간 동안 반응 시킨 후, UV-VIS분광 광도계(uv- 1800 uv/visible scanning spectrophotometer SHIMADZU)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로 quercetin(Sigma-Aldrich)을 사용하여 mg Quercetin Equivalent(QE)/g으로 나타내었다(NFRI, 1990). 홍삼의 추출법 및 농도 별 독성 여부를 확인하기 위해 RAW264.7 대식 세포와 EZ-Cytox 키트(DOGEN, Seoul, Korea)를 사용하여 Water-Soluble Tetrazolium (WST) assay를 실시하였다. 2 × 104 개의 RAW264.7 세포가 깔린 96 well plate에 홍삼 추출물 0, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL의 농도 별로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 100 μL 배지당 EZ-Cytox 10 μL를 첨가하여 3시간 후 microplate reader(Tecan Sunrise-Basic, Männedorf, Swiss)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 홍삼이 없는 배지를 처리한 세포군(대조군)을 100 %로 기준하여 상대적 비율로 계산하였다. 항염증 활성은 western blot 분석을 통해 COX-2의 단백질 발현량을 측정하였다. Raw 264.7을 6 well plate에 배양 후 0, 100, 200 μg/mL 농도의 홍삼 추출물에서 24시간 동안 배양하였다. 염증 반응 유도를 위해 1 μg/mL LPS를 추가로 24시간 처리한 후, 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하였다. Protease inhibitor (Roche, Mannheim, Germany)와 phosphatase inhibitor (Roche)가 들어간 lysis buffer(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 10 mL에 세포를 용해한 후에 4 °C, 110 × g에서 20분 간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)로 단백질을 정량 하여, 각 30 ㎍의 단백질을 10 % polyacrylamide gel에 넣어 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)로 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기(BIORAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane(Sigma-Aldrich)에 옮긴 다음, 실온에서 1시간 동안 blocking buffer(5 % skim milk in tris-buffered saline and tween 20 (TTBS), VWR Life Science, Suwon, Korea)에 방치하였다. COX-2 단백질 발현량을 확인하기 위해 COX-2 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, USA), b-actin(Santa Cruz, Dallas, TX, USA) 1차 항체를 1:1,000으로 희석하여 4 °C에 16시간 반응 후, 5분 간격으로 TTBS로 3 회 세척하였다. COX-2의 2차 항체는 horseradish peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology)를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 배양한 후 TTBS로 5분 간 3회 세척하였다. b-actin의 2차 항체는 anti-mouse(Santa Cruz, Dallas, TX, USA)를 사용하고 1:1,000 비율로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 다시 TTBS로 3회 세척한 후 membrane에 Ez West Lumi-plus(ATTO, Tokyo, Japan)를 분주하여 Chemi-doc(LuminoGraphII, ATTO Co., Tokyo, Japan)로 단백질을 가시화하고, CS Analyzer 4(ATTO)를 사용하여 COX-2와 b–actin을 정량화 하였다. COX-2 단백질 량은 b-actin 단백질 량에 대한 백분율(%)로 나타내었다.